單細胞分離--測序原理
10X Genomics採用Drop-Seq技術， 橫向孔道逐個導入凝膠微珠Gel beads，第一個縱向道輸入細胞。當凝膠微珠和細胞碰撞會被吸附在微珠上，然後通過微流控技術運送到第二個縱向通道（“油管”）。這時就會形成一個個的油滴GEMs（一個油滴就是一個凝膠微珠，也就是一個單細胞），然後收集在EP管中。每一個凝膠微珠都佈滿了不同的Barcode和UMI連接的序列，然後再加上PolyT就形成了像“刺”一樣的捕獲抓手，隨後細胞裂解，利用3'端 poly(A) 鹼基互補特定抓取mRNA構建轉錄文庫。據說可以7分鐘內完成100~80,000個細胞的捕獲
簡而言之：一個油滴 = 一個細胞（單細胞） = 一個RNA_Seq
文庫構建
read1：主要用來定量
read2：真正需要測序的mRNA序列
Barcode：用於標記每一個細胞
UMI：標記每一個細胞當中的每一個轉錄本（即標記基因）
PolyT：用於捕獲PolyA尾巴的mRNA，進行反轉錄反應
10X genomics單細胞測序通過Barcode來標記細胞，UMI 來標記轉錄本，這樣與參考基因比對後就可以定量細胞以及基因的數量
備註：使用 UMI 計數方法（ UMI 計數，是指在建庫過程中，通過在引物上，增加隨機序列，則對於同一種 mRNA 連上同樣的 UMI 概率幾乎爲 0，則我們可以忽略由於 PCR 造成的誤差，對於一種 mRNA，測到的 UMI 數量可以近似看成 mRNA 的表達個數）
細胞的質控（非reads的質控）
由於每個單細胞都是獨特的，不可能開展重複實驗並評估噪音。因此，必須採取一些質量控制手段，以確保數據的可靠性。專家建議，向每個細胞裂解液中加入已知序列和數量的合成mRNA，如外源RNA對照聯盟（ERCC）開發的加標RNA（10X genomics 官網有提供ERCC相關的參考基因組下載）。這些RNA的讀數將提供樣本間差異的信息。
細胞的過濾（非reads的過濾）
根據基因的表達量等特徵，對細胞進行過濾，通常的做法就是指定一個閾值，比如要求一個細胞中檢測到的基因數必須大於100，纔可以進入到下游分析，如果小於這個數字，就過濾掉該細胞。需要強調的是，在設定過濾的閾值時，需要人爲判斷，這樣的設定方式會受到主觀因素的干擾，所以往往都會指定一個非常小的過濾範圍，保證只過濾掉極少數的離羣值點。
細胞聚類
細胞聚類允許我們推斷細胞類型。根據細胞基因表達譜的相似性對細胞進行分組，得到細胞簇。通過距離度量來確定表達譜相似性，通常將降維結果作爲輸入。相似性評分的一個常見示例是歐幾里德距離，該距離在 PC 縮減的表達空間上計算。在R包Seurat中，不是直接對所有細胞進行聚類分析，而是首先進行PCA主成分分析，然後挑選貢獻量最大的幾個主成分（也相當於做了特徵選擇），用挑選出的主成分的值來進行聚類分析。聚類分析是下游分析的主要和首要步驟，因爲聚類後，各個細胞就有了groupinfo（即標籤），可用於後續的差異表達分析，找出各細胞組間顯著差異的genes，然後做GO,KEGG富集分析。
