學習指導
發酵工程是利用微生物的生命活動來製備微生物菌體，生產微生物代謝產物或實現物質轉化的工程技術。掌握工業發酵生產常用微生物的形態，生物特點是學習的基礎，掌握微生物菌種的篩選、培養基的配製、菌種的擴大培養、發酵操作方式及工藝條件的控制是學習的重點。認識發酵基本過程及常用的發酵設備。瞭解典型發酵產品的生產工藝。
內容簡介
發酵工程是生物技術的重要組成部分，是生物技術產業化的重要環節。它將微生物學、生物化學和化學工程學的基本原理有機地結合起來，是一門利用微生物的生長和代謝活動來生產各種有用物質的工程技術。由於它以培養微生物爲主，所以又稱微生物工程。生物化學上定義發酵爲“微生物在無氧時的代謝過程”。目前，人們把利用微生物在有氧或無氧條件下的生命活動來製備微生物菌體或其代謝產物的程統稱爲發酵。早在幾千年前，人們就開始從事釀酒。制醬、制奶酪等生產。作爲現代科學概念的微生物發酵工業，是在40年代隨着抗生素工業的興起而得到迅速發展的。
發酵是指利用微生物製造工業原料或工業產品的過程。根據各種微生物的特性，在有氧或無氧條件下利用生物催化(酶)的作用，將多種低值原料轉化成不同的產品的過程。如釀酒、制醬和醋等發酵技術古已有之。
微生物發酵過程
微生物發酵過程即微生物反應過程，是指由微生物在生長繁殖過程中所引起的生化反應過程。
根據微生物的種類不同（好氧、厭氧、兼性厭氧），可以分爲好氧性發酵和厭氧性發酵兩大類。
（1）好氧性發酵 在發酵過程中需要不斷地通人一定量的無菌空氣，如利用黑麴黴進行檸檬酸發酵、利用棒狀桿菌進行穀氨酸發酵、利用黃單抱菌進行多糖發酵等等。
（2）厭氧性發酵 在發酵時不需要供給空氣，如乳酸桿菌引起的乳酸發酵、梭狀芽抱桿菌引起的丙酮、丁醇發酵等。
（3）兼性發酵 酵母菌是兼性厭氧微生物，它在缺氧條件下進行厭氣性發酵積累酒精，而在有氧即通氣條件下則進行好氧性發酵，大量繁殖菌體細胞。
按照設備來分，發酵又可分爲敞口發酵、密閉發酵、淺盤發酵和深層發酵。
一般敞口發酵應用於繁殖快並進行好氧發酵的類型，如酵母生產，由於其菌體迅速而大量繁殖，可抑制其他雜菌生長。所以敞口發酵設備要求簡單。相反，密閉發酵是在密閉的設備內進行，所以設備要求嚴格，工藝也較複雜。淺盤發酵（表面培養法）是利用淺盤僅裝一薄層培養液，接人菌種後進行表面培養，在液體上面形成一層菌膜。在缺乏通氣設備時，對一些繁殖快的好氧性微生物可利用此法。深層發酵法是指在液體培養基內部（不僅僅在表面）進行的微生物培養過程。
液體深層發酵是在青黴素等抗生素的生產中發展起來的技術。同其他發酵方法相比，它具有很多優點：
①液體懸浮狀態是很多微生物的最適生長環境。
②在液體中，菌體及營養物、產物（包括熱量）易於擴散，使發酵可在均質或擬均質條件下進行，便於控制，易於擴大生產規模。
③液體輸送方便，易於機械化操作。
④廠房面積小，生產效率高，易進行自動化控制，產品質量穩定。
⑤產品易於提取、精製等。因而液體深層發酵在發酵工業中被廣泛應用。
工業生產常用微生物
微生物資源非常豐富，廣佈於土壤、水和空氣中，尤以土壤中爲最多。有的微生物從自然界中分離出來就能夠被利用，有的需要對分離到的野生菌株進行人工誘變，得到突變株才能被利用。當前發酵工業所用菌種的總趨勢是從野生菌轉向變異菌，從自然選育轉向代謝控制育種，從誘發基因突變轉向基因重組的定向育種。工業生產上常用的微生物主要是細菌、放線菌、酵母菌和黴菌，由於發酵工程本身的發展以及遺傳工程的介人，藻類、病毒等也正在逐步地變爲工業生產用的微生物。其他微生物有擔子菌、 藻類。
培養基
培養基的種類
培養基是人們提供微生物生長繁殖和生物合成各種代謝產物需要的多種營養物質的混合物。培養基的成分和配比，對微生物的生長、發育、代謝及產物積累，甚至對發酵工業的生產工藝都有很大的影響。依據其在生產中的用途，可將培養基分成抱子
培養基、種子培養基和發酵培養基等。
（1）抱子培養基抱於培養基是供製備泡子用的。
（2）種於培養基 種子培養基是供抱子發芽和菌體生長繁殖用的。
（3）發酵培養基 發酵培養基是供菌體生長繁殖和合成大量代謝產物用的。
發酵培養基的組成
發酵培養基的組成和配比由於菌種不同，設備和工藝不同以及原料來源和質量不同而有所差別。因此，需要根據不同要求考慮所用培養基的成分與配比。但是綜合所用培養基的營養成分，不外乎是碳源（包括用作消泡劑的油類）、氮源、無機鹽類（包括微量元素）、生長因子、水、產物形成的誘導物、前體和促進劑等幾類。
發酵的一般過程
生物發酵工藝多種多樣，但基本上包括菌種製備、種子培養、發酵和提取精製等下游處理幾個過程。典型的發酵過程如圖所示。以下以黴菌發酵爲例加以說明。
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菌種
在進行發酵生產之前，首先必須從自然界分離得到能產生所需產物的菌種，並經分離、純化及選育後或是經基因工程改造後的"工程菌"．才能供給發酵使用。爲了能保持和獲得穩定的高產菌株，還需要定期進行菌種純化和育種，篩選出高產量和高質錄的優良菌株。
種子擴大培養
種子擴大培養是指將保存在砂上管，冷凍乾燥管或冰箱中處於休眠狀態的生產菌種，接入試管斜面活化後，再經過茄子瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養而獲得一定數量和質量的純種的過程。這些純種培養物稱爲種子。
發酵產物的產量與成品的質量，與菌種性能以及抱於和種子的製備情況密切相關。先將貯存的菌種進行生長繁殖，以獲得良好的抱子，再用所得的抱子製備足夠量的菌絲體，供發酵罐發酵使用。種子製備有不同的方式，有的從搖瓶培養開始，將所得搖瓶種子液接入到種子罐進行逐級擴大培養，稱爲菌絲進罐培養；有的將泡了百接接入種子罐進行擴大培養，稱爲抱子進罐培養。採用哪種方式和多少培養級數，取決於菌種的性質。生產規模的大小和生產工藝的特點，種子製備一般使用種子罐，擴大培養級數通常爲二級。種廠製備的工藝流程如圖4－2所示示。對於不產孢子的菌種，經試管培養直接得到菌體，再經搖瓶培養後即可作爲種子罐種子。
發酵
發酵是微生物合成大量產物的過程，是整個發酵工程的中心環節。它是在無菌狀態下進行純種培養的過程。因此，所用的培養基和培養設備都必須經過滅菌，通入的空氣或中途的補料都是無菌的，轉移種子也要採用無菌接種技術。通常利用飽和蒸汽對培養基進行滅菌，滅菌條件是在120℃（約0.1MPa表壓）維持20～30min。空氣除菌則採用介質過濾的方法，可用定期滅菌的乾燥介質來阻截流過的空氣中所含的微生物，從而製得無菌空氣。發酵罐內部的代謝變化（菌絲形態、菌濃、糖、氮含量、PH值，溶氧濃度和產物濃度等）是比較複雜的，特別是次級代謝產物發酵就更爲複雜，它受許多因素控制。
下游處理
發酵結束後，要對發酵液或生物細胞進行分離和提取精製，將發酵產物製成合乎要求的成品。
發酵的操作方式
根據操作方式的不同，發酵過程主要有分批發酵、連續發酵和補料分批發酵三種類型。
分批發酵
營養物和菌種一次加入進行培養，直到結束放出，中間除了空氣進入和尾氣排出，與外部沒有物料交換。傳統的生物產品發酵多用此過程，它除了控制溫度和PH及通氣以外，不進行任何其他控制，操作簡單。但從細胞所處的環境來看，則明顯改變，發酵初期營養物過多可能抑制微生物的生長，而發酵的中後期可能又因爲營養物減少而降低培養效率，從細胞的增殖來說，初期細胞濃度低，增長慢，後期細胞濃度雖高，但營養物濃度過低也長不快，總的生產能力不是很高。
分批發酵的具體操作如下
首先種子培養系統開始工作，即對種子罐用高壓蒸汽進行空罐滅菌（空消），之後投入培養基再通高壓蒸汽進行實罐滅菌（實消），然後接種，即接入用搖瓶等預先培養好的種子，進行培養。在種子罐開始培養的同時，以同樣程序進行主培養罐的準備工作。對於大型發酵罐，一般不在罐內對培養基滅菌，而是利用專門的滅菌裝置對培養基進行連續滅菌（連消）。種子培養達到一定菌體量時，即轉移到主發酵罐中。發酵過程中要控制溫度和PH，對於需氧微生物還要進行攪拌和通氣。主罐發酵結束即將發酵液送往提取、精製工段進行後處理。
根據不同發酵類型，每批發酵需要十幾個小時到幾周時間。其全過程包括空罐滅菌、加入滅過菌的培養基、接種、培養的誘導期、發酵過程、放罐和洗罐，所需時間的總和爲一個發酵週期。
分批培養系統屬於封閉系統，只能在一段有限的時間內維持微生物的增殖，微生物處在限制性條件下的生長，表現出典型的生長週期。
培養基在接種後，在一段時間內細胞濃度的增加常不明顯，這一階段爲延滯期，延滯期是細胞在新的培養環境中表現出來的一個適應階段。接着是一個短暫的加速期，細胞開始大量繁殖，很快到達指數生長期。在指數生長期，由於培養基中的營養物質比較充足，有害代謝物很少，所以細胞的生長不受限制，細胞濃度隨培養時間呈指數增長，也稱對數生長期。隨着細胞的大量繁殖，培養基中的營養物質迅速消耗，加上有害代謝物的積累，細胞的生長速率逐漸下降，進人減速期。因營養物質耗盡或有害物質的大量積累，使細胞濃度不再增大，這一階段爲靜止期或穩定期。在靜止期，細胞的濃度達到最大值。最後由於環境惡化，細胞開始死亡，活細胞濃度不斷下降，這一階段爲衰亡期。大多數分批發酵在到達衰亡期前就結束了。迄今爲止，分批培養是常用的培養方法，廣泛用於多種發酵過程。
連續發酵
所謂連續發酵，是指以一定的速度向發酵罐內添加新鮮培養基，同時以相同的速度流出培養液，從而使發酵罐內的液量維持恆定，微生物在穩定狀態下生長。穩定狀態可以有效地延長分批培養中的對數期。在穩定的狀態下，微生物所處的環境條件，如營養物濃度、產物濃度、PH值等都能保持恆定，微生物細胞的濃度及其比生長速率也可維持不變，甚至還可以根據需要來調節生長速度。
連續發酵使用的反應器可以是攪拌罐式反應器，也可以是管式反應器。在罐式反應器中，即使加入的物料中不含有菌體，只要反應器內含有一定量的菌體，在一定進料流量範圍內，就可實現穩態操作。罐式連續發酵的設備與分批發酵設備無根本差別，一般可採用原有發酵罐改裝。根據所用罐數，罐式連續發酵系統又可分單罐連續發酵和多罐連續發酵（如圖所示）。
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(單罐連續發酵)
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(多罐連續發酵)
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如果在反應器中進行充分的攪拌，則培養液中各處的組成相同，且與流出液的組成一樣，成爲一個連續流動攪拌罐式反應器（CSTR）。連續發酵的控制方式有兩種：一種爲恆濁器（turbidostat）法，即利用濁度來檢測細胞的濃度，通過自控儀表調節輸入料液的流量，以控制培養液中的菌體濃度達到恆定值；另一種爲恆化器（chemostat）它與前者的相似之處是維持一定的體積，不同之處是菌體濃度不是直接控制的，而是通過恆定輸入的養料中某一種生長限制基質的濃度來控制。
在管式反應器中，培養液通過一個返混程度較低的管狀反應器向前流動（返混--反應器內停留時間不同的料液之間的混合），其理想型式爲活塞流反應器（PFR，沒有返混）。在反應器內沿流動方向的不同部位，營養物濃度。細胞濃度、傳氧和生產率等都不相同。在反應器的人口，微生物細胞必須和營養液一起加到反應器內。通常在反應器的出口，裝一支路使細胞返回，或者來自另一個連續培養罐。這種微生物反應器的運轉存在許多困難，故目前主要用於理論研究，基本上還未進行實際應用。
與分批發酵相比，連續發酵具有以下優點：
①可以維持穩定的操作條件，有利於微生物的生長代謝，從而使產率和產品質量也相應保持穩定；
②能夠更有效地實現機械化和自動化，降低勞動強度，減少操作人員與病原微生物和毒性產物接觸的機會；
③減少設備清洗。準備和滅菌等非生產佔用時間，提高設備利用率，節省勞動力和工時；
④由於滅菌次數減少，使測量儀器探頭的壽命得以延長；
⑤容易對過程進行優化，有效地提高發酵產率。
當然，它也存在一些缺點：
①由於是開放系統，加上發酵週期長，容易造成雜菌污染；
②在長週期連續發酵中，微生物容易發生變異；
③對設備、儀器及控制元器件的技術要求較高；
④粘性絲狀菌菌體容易附着在器壁上生長和在發酵液內結團，給連續發酵操作帶來困難。
由於上述情況，連續發酵目前主要用於研究工作中，如發酵動力學參數的測定，過程條件的優化試驗等等，而在工業生產中的應用還不多。連續培養方法可用於麪包酵母和飼料酵母的生產，以及有機廢水的活性污泥處理。另外，酒精連續發酵生產技術在前蘇聯也已獲得成功的應用。而新近發展的一種培養方法則是把固定化細胞技術和連續培養方法結合起來，用於生產丙酮、丁醇、正丁醇、異丙醇等重要工業溶劑。
補料分批發酵
補料分批發酵又稱半連續發酵，是介於分批發酵和連續發酵之間的一種發酵技術，是指在微生物分批發酵中，以某種方式向培養系統補加一定物料的培養技術。通過向培養系統中補充物料，可以使培養液中的營養物濃度較長時間地保持在一定範圍內，既保證微生物的生長需要，又不造成不利影響，從而達到提高產率的目的。
| 補料在發酵過程中的應用，是發酵技術上一個劃時代的進步。補料技術本身也由少次多量、少量多次，逐步改爲流加，近年又實現了流加補料的微機控制。但是，發酵過程中的補料量或補料率，目前在生產中還只是憑經驗確定，或者根據一、兩個一次檢測的靜態參數（如基質殘留量、PH、溶解氧濃度等）設定控制點，帶有一定的盲目性，很難同步地滿足微生物生長和產物合成的需要，也不可能完全避免基質的凋控反應。因而現在的研究重點在於如何實現補料的優化控制。 補料分批發酵可以分爲兩種類型：單一補料分批發酵和反覆補料分批發酵。在開始時投入一定量的基礎培養基，到發酵過程的適當時期，開始連續補加碳源或（和）氮源或（和）其他必需基質，直到發酵液體積達到發酵罐最大操作容積後，停止補料，最後將發酵液一次全部放出。這種操作方式稱爲單一補料分批發酵。該操作方式受發酵罐操作容積的限制，發酵週期只能控制在較短的範圍內。反覆補料分批發酵是在單一補料分批發酵的基礎上，每隔一定時間按一定比例放出一部分發酵液，使發酵液體積始終不超過發酵罐的最大操作容積，從而在理論上可以延長髮酵週期，直至發酵產率明顯下降，才最終將發酵液全部放出。這種操作類型既保留了單一補料分批發酵的優點，又避免了它的缺點。補料分批發酵作爲分批發酵向連續發酵的過渡，兼有兩者之優點，而且克服了兩者之缺點。同傳統的分批發酵相比，它的優越性是明顯的。首先它可以解除營養物基質的抑制，產物反饋抑制和葡萄糖分解阻遏效應（葡萄糖效應--葡萄糖被快速分解代謝所積累的產物在抑制所需產物合成的同時，也抑制其他一些碳源、氮源的分解利用）。 |
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（補料在發酵過程中的應用）
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對於好氧發酵，它可以避免在分批發酵中因一次性投入糖過多造成細胞大量生長，耗氧過多，以至通風攪拌設備不能匹配的狀況，還可以在某些情況下減少菌體生成量，提高有用產物的轉化率 在真菌培養中，菌絲的減少可以降低發酵液的粘度，便於物料輸送及後處理 與連續發酵相比，它不會產生菌種老化和變異問題，其適用範圍也比連續發酵廣。
目前，運用補料分批發酵技術進行生產和研究的範圍十分廣泛，包括中細胞蛋白、氨基酸、生長激素、抗生素、維生素、酶製劑、有機溶劑、有機酸、核苷酸、高聚物等，幾乎遍及整個發酵行業。它不僅被廣泛用於液體發酵中，在固體發酵及混合培養中也有應用。隨着研究工作的深入及微機在發酵過程自動控制中的應用，補料分批發酵技術將日益發揮出其巨大的優勢。
發酵工藝控制
| 發酵過程中，爲了能對生產過程進行必要的控制，需要對有關工藝參數進行定期取樣測定或進行連續測量。有關的參數如表42所示。反映發酵過程變化的參數可以分爲兩類：一類是可以直接採用特定的傳感器檢測的參數。它們包括反映物理環境和化學環境變化的參數，如溫度、壓力、攪拌功率、轉速、泡沫、發酵液粘度、濁度、PH、離子濃度、溶解氧、基質濃度等，稱爲直接參數。另一類是至今尚難於用傳感器來檢測的參數，包括細胞生長速率、產物合成速率和呼吸嫡等。這些參數需要根據一些直接檢測出來的參數，藉助於電腦計算和特定的數學模型才能得到。因此這類參數被稱爲間接參數。上述參數中，對發酵過程影響較大的有溫度、PH、溶解氧濃度等。 |
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