光聲成像之前的成像方式對比
X射線成像：
優點：能對骨頭和硬組織進行深度成像，有着很強的對比度和極高的分辨率
缺點：對軟組織成像很差，能反映的功能信息少，對人體有傷害
超聲成像（USI）
優點：安全、費用低、易於攜帶、分辨率高。陳橫向深度深、對聲阻抗匹配好的組織靈敏度高，對軟組織成像對比度高
缺點：骨頭和氣腔會阻礙超聲傳播，對探測腫瘤的靈敏度低。
磁共振：（MRI）
優點：由於對水分子有很高的靈敏度，對軟組織的成像有很高的對比度，對深度成像有很高的分辨率，而且對人體沒有傷害
缺點：價格昂貴，探測腫瘤時還要用造影劑以增加對比度。
1.光聲成像簡介
在宏觀尺度上，許多方法，包括磁共振成像，X射線計算機斷層掃描和超聲成像，對於解剖成像實現了極好的穿透。正電子發射斷層掃描和單光子發射計算機斷層掃描實現了深度穿透，並對放射性標記的分子探針表現出高靈敏度。在微觀尺度上，光學顯微鏡可以在淺表深度處詳細描述具有亞細胞和亞細胞分辨率的生物現象。然而，這些成像工具的不同成像對比機制和長度尺度阻礙了生物學問題的相關多尺度研究。因此，必須在生命科學中建立從微觀到宏觀成像的連續體。
在過去十年中，光聲成像已被證明能夠進行多尺度成像，並具有一致的對比機制;因此，它很好地橋接了生命科學中的微觀和宏觀領域。 PAT是一種混合成像模式，通過光聲（PA）效應在聲學上檢測光學吸收對比度，這是一種將吸收的光能轉換爲聲能的物理現象。
光聲效應
光聲效應指目標組織吸收通過其的光而發出聲波。當採用激光照射目標物體時，目標物體會吸收激光的能力，導致其溫度上升，從而使目標組織體積發生變化，即發生熱脹冷縮現象。而當目標被週期性強度調製的激光照射時，會發生週期性的熱脹冷縮，從而激發目標發出超聲波，當停止激光照射時，目標恢復原狀。
光聲成像檢測的是組織受光激發而產生的超聲信號。在成像過程中，組織受電磁照射後產生熱膨脹，在組織內部形成一個初始聲場。超聲換能器在組織周圍接收到傳播出來的聲波，利用聲波信號和相應的重建算法，反向重建出初始聲場，從而得到組織的電磁吸收分佈重建。
光聲成像的目標就是從傳感器接收到的聲信號計算目標組織的光吸收分佈。超聲波換能器探測到光聲波後，就可採用相應的圖像重建算法計算出組織內部的光吸收分佈圖像。由於樣品內部不同深度位置的聲信號到達樣品表面的超聲信號存在時間差異，因此，利用時間分辨技術可以獲得不同層析面的光聲信號，從而獲得組織的三維光聲圖像。（由於樣品介質的散射作用，使得樣品內部目標組織被均勻照射）
光聲成像原理
成像過程通常以在生物組織中發射的短激光脈衝開始。隨着光子傳播到組織中，一些被生物分子吸收（例如，血紅蛋白，DNA-RNA，脂質，水，黑色素和細胞色素）。 PAT中的各種吸收機制包括（但不限於）電子吸收，振動吸收，受激拉曼吸收和表面等離子體共振吸收。吸收的光能通常通過激發分子的非輻射弛豫部分或完全轉化爲熱量。熱感應壓力波作爲超聲波在組織中傳播。通過超聲換能器或換能器陣列在組織外部檢測超聲波，以形成映射組織內原始光能沉積的圖像。 PAT對光吸收的微小變化具有100％的相對靈敏度，這意味着光吸收係數的給定百分比變化產生PA信號幅度的相同百分比變化。
光聲成像主要組成部分
典型光聲成像系統的主要組成部分包括短脈衝激光器（例如，納秒Q開關Nd：YAG激光器），用於有效的寬帶PA信號發生;用於信號檢測的寬帶超聲換能器或換能器陣列;用於信號放大和數字化的數據採集系統;以及用於系統同步，數據收集和圖像形成的計算機。換能器的帶寬應與來自所需深度的小型光學吸收器的PA信號的帶寬相匹配，並且能夠承受組織的頻率依賴性聲學衰減。匹配寬帶檢測可優化信噪比，從而優化檢測靈敏度和軸向分辨率。
光聲成像優點
（1）使用非電離輻射，是一種無損的醫學成像技術
（2）光聲成像結合了光學成像的高對比度和超聲成像的高分辨率。根據光聲成像技術的原理，它反映的是組織的光吸收分佈，對比度高：光學成像解決超聲成像對比度不高，無法有效監測早期腫瘤的問題（血紅細胞的光吸收很強）；成像過程中探測的是超聲信號，成像的分辨率高：光學成像中，光散射使得成像分辨率隨着成像深度大幅降低，生物組織內的超聲散射比光散射弱二至三個兩級，因此對於超過1毫米的深度，超聲成像比光學成像分辨率高。因爲生物組織對聲音比對光更透明，所以就散射平均自由程而言，PAT提供了比光學顯微鏡更大的穿透性和可擴展的空間分辨率。
（3）光聲成像本身適用於通過內源性對比進行功能，代謝和組織學成像，以及通過外部對比進行分子和細胞成像。
（4）光聲成像與其他成像模式互補併兼容，尤其是光學成像和超聲成像。
2.光聲成像分類
根據電磁波照射方式的不同（聚焦或非聚焦），使用的超聲換能器的不同（單個或陣列，聚焦或非聚焦）、圖像形成方法的不同（反演重建或B型掃描成像）等等，光聲成像可分爲多種類型，其中最主流、最有發展潛力的是層析成像技術和顯微成像技術。
光聲層析成像技術（photoacoustic tomography PAT）：用電磁波均勻照射整個待測物體，並用非聚焦換能器掃描接收光聲信號，得到整個組織的圖像。光聲層析成像系統的掃描方式主要有球形掃描、圓形掃描、平面掃描
光聲顯微成像技術（PAM）：用電磁波聚焦照射組織體表，同時用聚焦換能器接收信號，對體表微血管結構進行成像。PAM進一步分爲光學分辨率PAM（OR-PAM）和聲學分辨率PAM（AR-PAM）。光學分辨率PAM（OR-PAM），其中光學焦點比聲學焦點更緊密，而聲學分辨率PAM（AR-PAM）聲學焦點比漫射光束更緊密。在兩種情況下，軸向分辨率在聲學上確定。在OR-PAM中，光學確定的橫向分辨率通常比軸向分辨率更精細。根據所需的空間分辨率和穿透，光學聚焦可以強或弱。相反，在AR-PAM中，軸向分辨率通常比橫向分辨率更精細。
光聲內窺成像技術（PAE）
光聲顯微成像技術和光聲內窺技術主要目標是在毫米級的成像深度上實現微米級的分辨率。
光聲層析技術的探測深度和分辨率可在較大範圍內變化，既可以實現顯微成像，也可以實現大深度的成像。
3.圖像重建算法
圖像重建算法是光聲成像的一項關鍵技術，目前主要的重建方法有兩種，延遲求和法和反投影法。
重建算法：延時求和重建、反投影重建
反投影法：着重體現目標組織光吸收分佈的高頻部分，更側重於目標邊緣、細節的顯示
延時求和法：包含了目標光吸收分佈的高頻及低頻部分，更側重於目標組織結構的顯示。
濾波反投影與反Radon變換
時域重建法與頻域重建法
傅里葉變換重建法與有限元法：速度快（實時、活體的光聲成像系統）
難題：
（1）複雜組織的聲速測量問題。在光聲成像過程中，目標內部不同組織的聲速是否準確直接影響成像效果。大多數算法假定待測組織內聲速恆定，而實際中組織內聲速差異最大可達10%，會導致重建圖像的模糊及目標錯位
（2）大多數算法需要對光聲信號做全角度掃描探測，實際中往往無法做到全角度掃描
應用領域：腫瘤監測、血管成像、腦部結構和功能成像、流速檢測
4.光聲成像系統三個典型問題
關於研究與給定光聲成像系統的兼容性的三個典型問題涉及
（1）成像深度。
（2）成像速度或時間分辨率。
（3）成像對比度。
爲了最好地解決特定問題，可能需要以最佳方式權衡PAT的性能參數。下圖根據這三個標準 - 感興趣的深度，速度和對比度來分類主要的PAT實現。
成像深度
軟組織中的光子傳播可以鬆散地分爲四種方案，這些方案定義了各種高分辨率光學成像模式的穿透限制。如下圖：
PAT的空間分辨率與成像深度成比例，從準彈道區域（通常組織中≤1mm）到擴散區域（組織中通常≥10mm），達到耗散極限（~10 cm）。降低PAT的成像深度可以大致提高其空間分辨率。根據經驗，成像深度與分辨率之比約爲200，允許PAT在很寬的成像深度範圍內提供高分辨率成像。
成像深度方面：共焦顯微鏡、雙光子顯微鏡、PAM、PACT的比較。如下圖：
共聚焦顯微鏡的成像深度在生物組織中限制在100-200μm，因爲它依賴於在往返光學衰減中存活的極小數量的彈道光子。雙光子顯微鏡通過使用更長的激發波長來改善成像深度，這減少了光學衰減並拓寬了光學聚焦。然而，低雙光子激發效率和壓倒性表面信號仍然將穿透限制在約1.5mm。與雙光子顯微鏡相比，OR-PAM可以實現相似（如果不是更大）的成像深度，原因有兩個：（1）信號幅度線性地而不是二次方依賴於激發光強度，並且檢測可忽略不計聲衰減; （2）時間分辨聲學檢測有效地抑制了表面信號的干擾。然而，OR-PAM仍然依賴於準彈道光子來提供光學定義的橫向分辨率。如果空間分辨率放寬到幾十微米，這是可以實現的。通過高頻超聲波檢測，AR-PAM可以用於打破準擴散狀態（例如，在50MHz超聲波檢測時穿透約5mm），其中大多數光子經歷了許多散射事件。通過聲學定義的橫向分辨率，到達目標的彈道和散射光子都有助於PA信號。 AR-PAM的穿透在很大程度上受到高頻聲學衰減的限制，並且可以通過按比例放鬆的分辨率延伸至至少10 mm 。如果所需的空間分辨率進一步放寬至數百微米，這可通過低頻超聲波檢測（例如，5MHz）獲得，則PACT可用於達到擴散狀態，在活組織中穿透率高達70mm。然而，PACT仍然受到軟組織中耗散至小於10cm的限制，其中光通量 - 每單位面積接收的光子能量（J / cm 2） - 由於吸收和散射而基本上衰減。當使用波前工程技術補償光學散射效應時，可能會對全身人體成像的吸收極限（~1 m）進行充分的穿透。
空間分辨率
一旦確定了期望的成像深度，就可以估計可實現的空間分辨率。
對於準彈道方案中的成像，優選OR-PAM，因爲它可以分辨單個細胞或細胞器。 OR-PAM可用於研究癌症血管生成，其中新毛細血管的直徑小於10μm，對於單細胞流式測量，其中單個細胞的功能是令人感興趣的。 AR-PAM優選用於準擴散方案中的成像。已經實現了約5mm的成像深度和組織水平（約50μm橫向和~15μm軸向）空間分辨率。爲了在擴散狀態下成像，達到小動物的全身深度，優選具有數百微米空間分辨率的PACT。
PAT的空間分辨率可以通過光學和聲學方式進行調整。如下圖：
對於OR-PAM，更短的激發波長和更緊密的光學聚焦產生更精細的橫向分辨率，並且更寬的超聲波檢測帶寬以兆赫爲單位提供更好的軸向分辨率。然而，值得注意的是，具有幾十兆赫檢測帶寬的OR-PAM的軸向分辨率在幾十微米的水平上。最近開發的具有超寬檢測帶寬（千兆赫茲）的OR-PAM提供了近似各向同性的分辨率。然而，超高頻超聲處的強聲衰減限制了單細胞研究的應用。對於AR-PAM，更寬的超聲檢測帶寬同樣提供更好的軸向分辨率，而更高的中心超聲檢測頻率有利於橫向分辨率。此外，更緊密的聲學聚焦以聚焦區爲代價提高了橫向分辨率，聚焦區被定義爲橫向分辨率降低至~1.4×的深度範圍。通過增加超聲換能器陣列的中心頻率和帶寬，可以改善PACT的空間分辨率。但是，在所有情況下，空間分辨率都會以滲透爲代價而得到改善。
最近已經實現了超過光學衍射極限的超分辨率OR-PAM。已經使用各種非線性機制來提高分辨率，包括光學吸收飽和度，光熱非線性，雙光子吸收，納米氣泡空化，熱或Grueneisen弛豫，光熱漂白和可逆光開關。正如在共聚焦顯微鏡和雙光子顯微鏡中一樣，除了增強橫向分辨率外，非線性OR-PAM自動實現光學切片，與時間分辨聲學切片相比，它提供至少十倍的軸向分辨率。常規線性OR-PAM。
成像速度：
生物功能發生在各種時間尺度上。 PAT的各種實現提供了廣泛的成像速度以及相關的折衷。科學家應該選擇只需要成像速度的成像系統，以便優化其他性能參數。
對於OR-PAM，可根據所需的成像速度採用不同的掃描機制。
對於AR-PAM，成像速度主要受機械掃描速度和高脈衝能量激光器的脈衝重複率的限制，後者受組織上激光曝光的安全性限制。
對於提供大視場的PACT，成像速度通常受激光器的脈衝重複率和多路複用數據採集所需的時間的限制。使用1D或2D超聲換能器陣列，理論上單個激光照射可以在整個視場上生成2D或3D圖像。然而，通常採用多路數據採集來降低成本，減慢了數據收集速度。 PACT中使用的市售高脈衝能量激光器通常以低於50Hz的重複率運行。此外，由於重複的寬場照明可能因累積加熱而導致組織損傷，因此應控制除組織表面上每個脈衝的流量（J / cm2）之外的平均注量率（W / cm2）以防止損壞。
成像對比度和靈敏度
爲了研究一種特定的生物現象，科學家們還需要確定一種最佳的成像對比度，能夠以高靈敏度或特異性或兩者來報告這種現象。因爲PAT不依賴於熒光，所以只要非輻射弛豫發生，理論上任何分子都可以成像爲PA對比度。 PAT已經廣泛研究了內源性和外源性造影劑。
內源性造影劑具有幾個主要優點：（1）無毒性，（2）對生物過程的非擾動，（3）丰度，以及（4）不受監管部門批准。 PAT中最常見的成像內源性造影劑包括DNA-RNA，血紅蛋白，黑色素，脂質和水。其中，血紅蛋白最常用於無標記血液動力學成像，提供有關血管直徑，總血紅蛋白濃度，血液氧合，血流量和氧代謝的解剖學，功能和代謝信息。
外源造影劑比內源造影劑具有兩個優點：（1）優化檢測靈敏度和（2）與靶向分子（如抗體）結合，選擇性結合受體進行分子成像。已經研究了多種外源造影劑 - 包括有機染料，熒光蛋白，非熒光蛋白和納米顆粒-用於高靈敏度PA分子成像。
PAT可以探測各種內源性或外源性吸收劑，以揭示體內生物系統的解剖學功能，代謝和分子/遺傳過程。內源性地，DNA / RNA，血紅蛋白，黑色素，水和脂質是重要的解剖學和功能性造影劑。在PAT中，內源性對比顯示組織的解剖學，功能，代謝和組織學特性，外源性對比提供分子和細胞特異性。 PAT的空間尺度涵蓋了細胞器，細胞，組織，器官和小動物。
靜態對比：
血紅蛋白：使用血紅蛋白在可見光範圍內的主要光學吸收超過其他吸收劑，PAT提供血液循環系統的全面解剖和功能成像。水和脂質濃度異常可能是重要的疾病指標。它們在近紅外範圍內相對較強的光學吸收允許PAT在體內大量深度處繪製它們的分佈。
黑色素：黑色素是皮膚和大多數黑色素瘤中的主要色素，具有從紫外到近紅外範圍的寬帶光學吸收，可以通過光譜法區分PAT對血紅蛋白的吸收。黑色素瘤解剖結構和周圍血管功能的同時成像爲理解腫瘤與其微環境之間的相互作用以及非侵入性檢測和分期黑色素瘤提供了前所未有的機會。
造影劑：外源造影劑進一步將PAT擴展到分子和遺傳成像。 納米粒子，有機染料和報告基因產物可以是優異的光聲造影劑。 金納米粒子的主要優勢在於它們的大吸收截面調整到光學窗口（~730 nm），最大限度地減少內源吸收並最大化成像深度。 此外，納米粒子的生物共軛能力使得有效的生物標記物靶向分子成像和藥物遞送。 最近，使用氧化鐵和金耦合的核 - 殼納米粒子作爲光聲造影劑導致了磁動勢PAT的發展，這顯着提高了對比度和特異性。
動態對比：
除上述靜態對比外，PAT還可以對兩種重要的動態對比進行成像：血流（血流動力學對比）和溫度變化（熱力學對比）。最近發現的光聲多普勒效應爲流動的PAT奠定了基礎
血流：
溫度變化：組織溫度監測
5.挑戰
（1）將其多尺度成像能力與自動圖像配準完全集成的單一PAT系統將是非常寶貴的。一個主要挑戰是不同成像深度所需的光學照明和聲學檢測的無縫組合。光學透明的超聲換能器或換能器陣列可以幫助簡化系統配置。
（2）小型化PAT系統對於自由移動動物的成像非常感興趣，特別是對於腦研究。小型化超聲換能器的相對低靈敏度和快速聲學掃描機制的有限選擇是目前的主要障礙。聲壓的高速寬視場光學檢測可以實現解決方案。
（3）仍然需要分辨率小於50nm的超分辨率PA方法來研究亞細胞結構，如樹突棘。這些方法可用於熒光和非熒光分子的超分辨率成像。現有非線性PA方法的信噪比仍不足以在高速下提供如此高的分辨率。基於甜甜圈形狀的照明方法，類似於受激發射耗盡（STED）顯微鏡，可能會進行調整，以提高分辨率。
（4）PAT的單分子檢測對於分子細胞生物學是非常需要的。需要開發具有高壓電效率和低聲阻抗的新型超聲波探測器。
（5）絕對定量PA測量深部組織的氧合和溫度仍然是一個挑戰，主要是因爲未知的局部光學注量，以及其他次要因素，如組織依賴性PA生成效率。需要新的成像方法和數學模型來更好地映射組織的光學特性。
（6）最後，對於深部腦中神經元活動的PAT，必須在NIR光譜區域中找到具有大吸收截面的動作電位或替代物（例如，電壓或鈣敏感蛋白）的新的基因可編碼指示。天然或由現有蛋白質改造而成。沿着這條線，非熒光NIR植物色素（例如，RpBphP）可能潛在地被工程化，因爲PA成像與報告動作電位形成對比。顱骨（特別是側顱骨）的強聲衰減和畸變是深部腦的單神經元PAT的另一個挑戰。這一挑戰的潛在解決方案是將PAT與X射線CT相結合，X射線CT爲顱骨的精確3D建模提供數據以進行聲學校正。